شمارش باكتري هاي هتروتروف

درحال مشاهده: شمارش باكتري هاي هتروتروف

ادعونی اهدای خون

شمارش باكتري هاي هتروتروف

۱۳۹۰/۰۵/۱۴

6:7

امیرحسین ستوده بیدختی

مقدمه
جانداران موجود در اكوسيستم هاي آبي را مي توان به دودسته اتو تروف و هتروتروف تقسيم كرد .
اورگانيسم هاي اتوتروف Auto tropic با مصرف انرژي خورشيدي عناصر را از ماده ساده بي جان استخراج مي كند و در ملكولهاي پيچيده ، زيستي كه سازنده جانداران هستند تثبيت مي نمايد. به عبارت ديگر با مصرف انرژي خورشيدي مواد آلي را از مواد معدني سنتز مي نمايند و به آنها توليد كننده Producer مي گويند.
اورگانيسم هاي هتروترف Heterotrophic براي كسب انرژي و ادامه حيات خود مجبور هستند از مواد آلي توليد شده توسط موجودات اتوتروفيك بهره گيرند كه به آنها Con sumer گويند.
حيات آبزيان تابع خواص فيزيكي ، شيميايي و توده بيولوژيكي است ، دما ، شفافيت ، تلاطم و اكسيژن و PH عوامل موثر بر حيات آبزيان مي باشد و حداقل اكسيژن محلول مورد نياز آبزيان پنج ميلي گرم در يك ليتر است. نقش ميكرو اورگانيسم ها در تحولات شيميايي :
باكتريها ، قارچ ها ، جلبك ها به عنوان كاتاليزور هاي زنده در تعدادي از فرايندهاي شيميايي در آب و خاك نقش دارند . از ديدگاه شيمي آب ميكرو ارگانيسم ها را مي توان در سه گروه عمده باكتريها ، قارچ ها و جلبك ها دسته بندي كرد.

قارچ ها و باكتري ها ( به استثناي باكتريهاي فتوسنتيك ) را كاتاليزورهاي محيط زيست مي دانند و تحت عنوان Reducers ساده كنندگان دسته بندي مي شوند چون تركيبات شيميايي را مي شكنند به انواع ساده تر تبديل مي كنند و از اين راه انرژي لازم براي سوخت و ساز و رشد خود را فراهم مي كنند و در واقع مصرف كنندگان انرژي شيميايي هستند. جلبكها را Producers توليد كننده يا پيل هاي خورشيدي براي آب مي نامند . زيرا انرژي نوراني را دريافت و به صورت انرژي شيميايي ذخيره مي كنند .باكتريهاي اتوتروفيك Autotrophic براي رشد خود احتياج به دريافت مواد آلي ندارند و در يك محيط كاملاً غير آلي به خوبي رشد مي كنند از دي اكسيد كربن يا ساير اشكال كربناتي ، به عنوان منبع كربن استفاده مي كنند و انرژي لازم خود را از طريق يك واكنش شيميايي كه با واسطه بيولوژيكي انجام مي شود تامين مي گردد . باكتريهاي اتوتروفيك از ساده ترين مواد معدني كليه آنزيم ها و پروتئين هاي پيچيده و ساير مواد مورد نياز براي فرايندهاي زيستي را سنتز مي كنند.

باكتريهاي هتروتروفيك براي تامين انرژي و كربن مورد نياز جهت ساخت توده زيستي خود نياز به دريافت مواد آلي دارند جلبكها اتوتروف و قارچ ها هتروتروف هستند.
باكتري هاي هتروتروف
(HPC)Heterotrophic Plate Count
اين باكتري ها ، مجموعه يي از باكتري هاي هوازي – بيهوازي اختياري هستند كه به جز دو جنس آن (Microcoucus,Bacillus) گرم منفي بوده و جنس هاي Alcaligenes, Moraxella, Serratia, Flavobacterium, Klebsiella, Pesudomonas, Citrobacter, Aeromonas, Enterobacter, Proteus و Acinitobacter را شامل مي شوند . جنس هاي غالب اين مجموعه ، باكتري هاي Flavobacterium, Enterobacter, Serratia, Pesudomonas و Acinitobacter هستند.
علاوه بر جنس ياد شده ، برخي از باكتري هاي هم در پزشكي نظير : Staphylococcus, Mycobacterium و Serratia نيز در تركيب باكتري هاي هتروتروف ممكن است حضور داشته باشند.
باكتري هاي هتروتروف ساكن طبيعي بدن انسان و حيوانات بوده و از طريق مدفوع دفع مي شوند . برگ درختان ، خاك ، آب ، قطره هاي باران و حتي بزاق دهان نيز تعداد متنابهي از اين باكتري ها را در خود جاي داده اند. هر اينچ مربع از پوست سالم انسان ، ميزبان صدها هزار باكتري هتروتروف است . اين باكتري ها در بسترهاي كربن فعال ، رزين ها ، صافي هاي ماسه اي و غشايي ، شبكه هاي توزيع و اجزاي آن ، خنك كننده ها ، مخازن تحت فشار و حتي جدار بطري هاي آب وجود داشته و اثر ناشي از تغيير جمعيت آن ها بر كيفيت آب و تاسيسات آب رساني با ضريب 10 تغيير مي كند . تغييرات جمعيت اين باكتري ها در شبكه ي توزيع از سه نظر حايز اهميت است :
1)    زيبايي شناختي : ايجاد طعم و بو ، تغيير رنگ ، ايجاد رشد لايه هاي لزج چسبنده (Slime)
2)    اقتصادي : نظير خوردگي ، رسوب گذاري و كاهش آبدهي
3)    بيماري زايي : باكتري هاي هتروتروف شاخص سلامت ميكروبي از نظر بيماري زايي نيستند ولي برخي از آن ها : ( E, coli O157 H7) بيماري زا و گروهي ديگر از آن ها ( سودوموناس عامل عفونت هاي پوستي و ريوي و آئروموناس عامل گاستر و آنتريت ) فرصت طلب هستند و از اين رو فراواني اين باكتري ها در آب آشاميدني مي تواند سلامت افرادي كه دچار سوختگي هاي شديد شده اند و يا تحت درمان باكورتيكوستروئيدها قرار دارند ، افراد مبتلا به بيماري سندروم نقص اكتسابي سيستم ايمني (ايدز) ، نوزادن ، سالخوردگان و زنان باردار كه همگي در زمره ي افراد آسيب پذير محسوب مي شوند را به مخاطره اندازد.
هر چند كه HPC به عنوان شاخص سلامت ميكروبي كمتر مورد توجه است ، اما شمارش و تعيين مقدار اين باكتري ها ،مشخص كننده ي چگونگي عملكرد و شاخص كنترل فرايند هاي تصفيه ي آب و تاسيسات شبكه ي توزيع محسوب مي شود و در موارد زير كاربرد دارد .
1-    ازريابي كارآمدي فرايند هاي تصفيه ي آب (انعقاد ، گندزدائي)
2-    كنترل كيفيت ميكروبي آب تصفيه شده در مخازن و شبكه
3-    تعيين نياز و يا عدم نياز به شست و شوي شبكه و مخزن
4-    تعيين كارآمدي شست و شوي شبكه و مخزن
5-    تعيين وقوع و ميزان رشد ميكروبي در تاسيسات
6-    تعيين احتمال وقوع رشد مجدد در شبكه ي توزيع
7-    تعيين كيفيت آب هاي بطري شده
بطور كلي تعداد شمارش شده ي باكتري هاي هتروتروف به نوع محيط كشت ، زمان و دماي انكوباسيون و سرانجام روش كشت بستگي داشته و با افزايش دما و زمان انكوباسيون تعداد شمارش شده ي آنها افزايش مي يابد .تعداد باگتري هاي HPC در شبكه هاي توزيع بنابر نظر Bitton(1999) از كمتر از 10 تا بيشتر از 104 كلني در هر ميلي ليتر و بر پايه ي اعلام انجمن كارهاي آبي ايالات متحده (AWWA) تا cfu/ml105 متغيير است .در شبكه ي توزيع آب شهري Ohio در ايالت Columbus ، تعداد اين باكتري ها تا cfu/ml107*1/3 اندازه گيري شده است كه اغلب آنها باكتري هاي احيا كننده ي سولفات بوده اند .
اندازه گيري تراكم باكتريهاي هتروتروف هوازي و بيهوازي اختياري در آب به نام پليت كانت هتروتروفيك ناميده مي شود كه روش استاندارد شده اي است . به خاطر اينكه بازيافتن تمام باكتريهاي موجود در يك نمونه آب با يك روش منحصر امكان پذير نيست ، روش هاي جديد براي بهبود بازيافت جمعيت باكتريايي هتروتروفيك گسترش يافته است و روش ها و محيط هاي كشت جديد شناخته شده است . با اين وجود هنوز هم تعيين واقعي جمعيت باكتريايي غير عملي است چون باكتريها به صورت تك ، دوتايي ، زنجيره اي ، خوشه اي و يا مكعبي و پاكتي در كنار هم قرار مي گيرند و هيچ متد منحصري و محيط كشت و شرايط فيزيكي خاص وجود ندارد كه بتواند نيازهاي فيزيولوژيكي كليه باكتريها را دريك نمونه آب برآورد كند . با روش ها و محيط هاي كشت جديد سعي بر اين است كه بازيافت هتروتروف ها را در كوتاهترين زمان افزايش داد . در ميان روشهاي موجود پليت كانت هتروتروفيك كارآمدترين روش در دسترس جهت اندازه گيري تاثير تيمار آب پس از طي خطوط انتقال و يا تعيين ميكروبي منبع آب مورد نظر مي باشد .
شمارش باكتريهاي HPC جهت بررسي تغييرات جمعيت ميكروبي در شبكه آب شرب شهري و تغييرات حاصله در آب ضمن فرآيند تصفيه مي باشد اين آزمون موثر بودن مراحل گندزدائي و نيز تاثيرات متقابل و مشكلات موجود در خطوط شبكه را مشخص مي كند .
تراكم باكتريهاي بيشتر از 500 تا 1000 ارگانيسم در ميلي ليتر ممكن است نشانه اي از بازدارندگي و سركوب كليفرمها باشد .
از اين آزمايش مي توان جهت تعيين كيفيت آب استخر هاي نيز استفاده نمود .گرچه در هيچ شرايطي شمارش پليت نشان دهنده تمام ارگانيسم هاي موجود در نمونه نمي باشد .اما اين روش جهت آزمونهاي مقايسه اي به حساب مي آيد .
كلني ها ممكن است به صورت دوتايي ، زنجيره اي ، خوشه اي و يا سلولهاي مجزا تشكيل شوند كه همه آنها به عنوان واحدهاي تشكيل دهنده كلني CFU شناخته مي شوند .
متد پورپليت (Poure plate) كه قبلاً به عنوان پليت كانت استاندارد شناخته شده بود ، اشكالات چندي دارد كه شمارش واقعي ماكزيمم تعداد باكتريها را صرفنظر از نوع محيط و زمان حرارت انكوباسيون بكار رفته دچار محدوديت مي كند : يكي اينكه محيط حرارت ديده تا Cْ44 الي C ْ46 مي تواند سبب ايجاد شوك حرارتي و استرس براي باكتريها شود و محيط غذايي غني هم در شمارش باكتريهاي گرسنه كاهش ايجاد كند .در تكنيك هاي ديگر سعي شده كه اين اشكالات برطرف شود .
متد پخش كردن درسطح پليت (Spread plate) شوك حرارتي ايجاد شده بوسيله آگار حرارت ديده را از بين مي برد . بعلاوه تمامي كلني ها در سطح آگار خواهند بود كه به راحتي ديده مي شوند و به سرعت مي توان شمارش را انجام داد و به آساني مي توان آنها را از ذرات يا حباب هاي هوا تشخيص داد . اين روش زمان و فضاي كمتري نسبت به متد پورپليت نياز دارد ، اما به خاطر استفاده از حجم كم نمونه محدوديت دارد : به اندازه 1/0 تا 5/0 ميلي ليتر بسته به ميزان جذب آگار مي توان از نمونه استفاده كرد .
متد فيلتر غشايي به ما اجازه مي دهد حجم زيادي از آبهايي كه كدورت كمي دارند را آزمايش كنيم و مخصوصاً براي آبهايي با شمارش پايين مفيد است . اشكالات شامل استفاده از پخش كننده ، آلوده شدن پليت هايي كه تهيه شده براي مدت طولاني نگهداري شده و شمارش هاي متنوع بسته به كيفيت فيلتر غشايي استفاده شده مي باشند .

شمارش پليت باكتريهاي هتروترف :
شمارش پليت باكتريهاي هتروترف كه قبلاً به عنوان شمارش پليت استاندارد شناخته شده بود . روشي است براي تخمين تعداد باكتريهاي هتروترف زنده در آب اين آزمايش اطلاعات بسيار سودمندي را درباره كيفيت آب و اطلاعات تاييد شده راجع به اهميت نتايج آزمايش كليفرم تامين مي نمايد .
غلظت زياد جمعيت باكتريهاي عمومي ممكن است مانع پوشش (مشخص شدن ) كليفرم ها شود .
HPC براي قضاوت درباره تاثير پروسه هاي مختلف تصفيه هم براي آب شرب و هم براي آب استخر ها و هم براي چك كردن كيفيت آب تمام شده در سيستم توزيع بسيار سودمند است سه روش مختلف براي نمايش HPC وجود دارد كه عباتند از ( پليت ايزوله شده ، پليت خالص و فيلتراسيون غشايي ) كه با استفاده از سه نوع مواد مختلف ، توصيف خواهد شد .

شرايط نمونه برداري
نمونه ها بايستي شامل تمام انواع آبهاي محيط زيست امان باشد . مانند منابع آب شرب ، آب درياچه ها ، استخرهاي شنا ، چاهها ، رودخانه ها و نمونه هاي لجن باشد .
مراحل مخصوص جمع آوري نمونه ها ، بايد پيش بيني شود تا اطمينان نمود كه نمونه گرفته شده از آب مورد آزمايش باشد . روشي كه يك نمونه جمع آوري مي گردد به عنوان يك فعاليت مهم در يافته هاي آزمايشگاهي به شمار مي رود .
نمونه هاي آب بايستي در ظرف هاي استريل 250 ميلي ليتري پروپيلن كه حاوي تيوسولفات سديم باشد به آزمايشگاه حمل شود ، نمونه هاي لجن در ظرفهاي پلاستيكي استريل و يا تنگهاي دهان گشاد استريل حمل شود .
نمونه نبايد از ماند آب مانند مرداب جمع آوري شود . براي چاههايي كه آب آنها توسط پمپ هاي مكانيكي و يا دستي برداشت مي شود . آب قبل از آنكه نمونه گيري شود بايد پمپ به مدت 5 دقيقه كاركند و بعد نمونه گيري شود تا مطمئن شد كه آب دقيقاً از تمام آب چاه جمع آوري گرديده باشد . درب ظرف نمونه بايد به دقت برداشته شود تا مطمئن بود كه آن نه لمس شده و نه آلوده گشته . بطري بايستي در ته چاه نگه داشته شود تا اينكه خط نشانه پر شود و هنگام بيرون كشيدن آن از چاه بايد دقت كرد كه پاشيده نشود .
نمونه هاي گرفته شده ( به طور مثال از درياچه ها و استخرها . . . ) مي تواند از طريق برداشتن بدقت درب بطري و گذاشتن آن در ته چاه بدست آمده باشد . بطري را بايد با ته در آب فرو برد و از برخورد آن با سطح كف چاه جلوگيري كرد . دهانه بطري را بايد در درون جريان دور از دست نمونه بردار قرار دهيد . نمونه بايد در حداقل زمان ممكن به آزمايشگاه فرستاده شوند تا اينكه بعد از جمع آوري در جمعيت ميكروبي حداقل تغييرات ايجاد شود .
حداكثر فاصله زماني جمع آوري و آزمايش نمونه 8 ساعت مي باشد (ماكزيمم زمان حمل 6 ساعت و ماكزيمم زمان نمونه برداري 2 ساعت )
مشاهدات نشان مي دهد كه نگهداري در يخجال به كاهش تغييرات در جمعيت و غلظت باكتري كمك مي كند .
بنابراين وقتي كه تجزيه در فاصله 8 ساعت صورت نگيرد نمونه را در درجه حرارت 4 درجه سانتيگراد نگهداري مي نمايند اما بايد مراقب بود كه نمونه يخ نزند . اجازه ندهيد كه مدت زمان مابين جمع آوري نمونه و آناليز آن از 24 ساعت تجاوز نمايد . اگر نمونه بعد از 24 ساعت به آزمايشگاه ارسال شود آزمايش را انجام ندهيد .
زمان برگشت به آزمايشگاه براي HPC نمونه هاي آب به شرح ذيل است .
1-    آب شرب / آب استخر 48 ساعت
2-    آب مقطر / آب ديونيزه / آب بطري 72 ساعت
3-    نمونه هاي مختلف آب (محيطهاي اطراف ) 48ساعت تا 7 روز

روشها و مواد HPC
سه مواد مختلف براي شمارش HPC وجود دارد كه شامل : (استاندارد متد آگار (SMA) و آگار R2A و آگار M-HPC . هرسه اين محيط كشت ها غير انتخابي بوده طوري كه آنها مواد مغذي و شرايط رشد را براي يك گونه باكتري هتروتروف فراهم مي آورد .
انتخاب اين مواد براي مصرف را تكنيك به كار رفته مشخص مي كند .
1-محيط استاندارد متد آگار : تكنيك Spread plate و pour plate

2-R2A آگار : تكنيك Spread plate وpour plate

3-آگار m-HPC : روش مامبران فيلتر (فيلتراسيون غشايي )

محدوديت هاي براي هر يك از روش ها بكار گرفته وجود دارد .

روش	محدوديت
Pour plate	از آنجايي كه يك كلني از يك سلول يا چندين سلول تكثير مي يابند شمارش هاي انجام شده براي واحدهاي سازنده كلني قابل زيست مي باشد نمونه هايي كه توسط مايع آگار براي مدت كوتاهي محصور ميگردد . ارگانيسم هاي بسياري كه قابليت زنده ماندن در چنين درجه حرارت را ندارند ممكن است از بين بروند
Spread plate	از آنجايي كه كلنيها توسط آگار محصور مي گردند باكتري هاي هوازي محيط قادر به تكثير تحت شرايط اين نوع آزمايش نيستند .اگر يك Plate spreader خودكار و يك نمونه سنگين از كلنيها كشت شده مورد استفاده قرار گيرد محاسبه براي تخمين تعداد پليت هاي كشت داده شده كاربردي نخواهد داشت .
Membrane Filtration	بعضي از نمونه ها كه شامل تعداد زيادي از مواد كلوئيدي يا جامدات معلق مي باشد ممكن است قابل فيلتراسيون نباشد

افشان عناياتي

منابع و ماخذ :

1- Standard Methods for the examination of water and wastewater 18th-edition 1992
2-Heterotropic Plate count(HPC) Bacteria
http://www.wqa.org/sitelogic
3- Microbiological Examination of water and waste water
By: Maria Csuras. Csaba Csuros 1999

4- آزمايش ميكروبي آب و پساب

تاليف : فدراسيون كنترل آلودگي آب ترجمه :دكتر گيتي امتيازي استاديار ميكروبيولوژي دانشگاه اصفهان

5- نتايج ميكروبي آزمايشگاه مركزي آب و فاضلاب استان اردبیل