مرجع تخصصی آب و فاضلاب

آزمایش‌های میکروبیولوژیک در آب و فاضلاب

۱. کل کلیفرم (Total Coliform)

• روش‌های اجرایی

  • MPN (Most Probable Number): لوله‌های سریالی لاورین با محیط لاکتوز براساس تغییر رنگ و تولید گاز

  • Membrane Filtration (MF): عبور 100 mL از فیلتر 0.45 µm، کشت روی محیط m-Endo یا m-T7 برای کل کلیفرم

  • Colilert/Quanti-Tray: کیت تجاری با معرف ONPG/MUG و خوانش فلورسنت/رنگ

• دستگاه‌ها و لوازم

  • انکوباتور 35 ± 0.5 °C

  • فیلتراسیون خلأ و فیلترهای استریل

  • Quanti-Tray Sealer/Incubator برای Colilert

• استانداردها و روش‌های مرجع

  • Standard Methods 9221 B/C (MPN, MF)

  • ISO 9308‑1 (MF برای coliforms)

  • EPA Method 9223 (Colilert)

• نکات اجرایی

  • نمونه‌برداری استریل و بدون هوا (zero‑headspace)

  • آنالیز حداکثر تا 8 h پس از برداشت، در 4 °C نگهداری

  • کنترل blank و positive/negative control

۲. کلیفرم مدفوعی و E. coli

• روش‌های اجرایی

  • MF روی MUG یا Chromogenic Agar: کلنی‌های فلورسنت آبی (E. coli) و قرمز (other coliforms)

  • Colilert‑18: تشخیص E. coli با فلورسنس MUG در 18 h

  • Chromagar ECC: تفکیک E. coli و کل مدفوعی

• دستگاه‌ها و لوازم

  • انکوباتور 44.5 °C برای مدفوعی/E. coli

  • دستگاه فلورسنس خوان (اختیاری)

  • فیلتر MF و پلیت‌های کروماتوگرافیک

• استانداردها و روش‌های مرجع

  • ISO 9308‑2 (MPN برای E. coli)

  • ISO 9308‑1 (MF روی Chromogenic)

  • EPA Method 1603 (MF on mTEC)

• نکات اجرایی

  • دقت دمای 44.5 °C ±0.2 °C برای تفکیک مدفوعی

  • بررسی نمونه‌های رقیق‌شده برای غلظت بالا

  • blank و کنترل کیفی

۳. کلستریدیوم پرتئین (Clostridium perfringens)

• روش‌های اجرایی

  • MF روی محیط m-CP: رشد کلنی سیاه براثر تولید سولفید هیدروژن

  • MPN با محیط Tryptose–Sulfite–Cycloserine (TSC): تغییر رنگ و رسوب سیاه

  • API 20A برای تأیید گونه

• دستگاه‌ها و لوازم

  • اتوکلاو برای استریل محیط و فیلترها

  • انکوباتور بی‌هوا (Anaerobic jar) به 37 °C

  • منابع گاز بی‌هوا برای محیط anaerobic

• استانداردها و روش‌های مرجع

  • ISO 6461‑2 (MF for C. perfringens)

  • Standard Methods 9260 B (MPN anaerobic)

• نکات اجرایی

  • نمونه‌برداری استریل و سریع انتقال به ظروف anaerobic

  • استفاده از کیت GasPak یا دستگاه anaerobic cabinet

  • کنترل عدم نشت هوا و تکرار آزمایش

۴. سالمونلا و شیگلا

• روش‌های اجرایی

  • چندمرحله‌ای غلظت/غلیظ‌سازی: فیلتراسیون یا رسوب‌گذاری (PEG, centrifugation)

  • Enrichment در محیطّی چون selenite F (Salmonella) یا Shigella Broth

  • کشت نهایی روی XLD, Hektoen, SS agar

  • تأیید با API 20E یا PCR برای ژن invA (Salmonella) و ipaH (Shigella)

• دستگاه‌ها و لوازم

  • انکوباتور 37 °C

  • سانتریفیوژ برای غلظت‌سازی

  • دستگاه PCR یا کیت‌های LAMP برای تأیید مولکولی

• استانداردها و روش‌های مرجع

  • ISO 19250 (Detection of Salmonella)

  • ISO 20838 (Detection of Shigella)

  • EPA Method 1682 (PCR detection)

• نکات اجرایی

  • حجم نمونه بزرگ (1–10 L) برای غلظت‌سازی

  • حفظ شرایط sterile و negative control در enrichment

  • زمان‌بر بودن نیاز به برنامه‌ریزی

۵. پروتوزوآ (Giardia, Cryptosporidium)

• روش‌های اجرایی

  • Filtration با فیلتری 1 µm یا 3 µm (EnviroChek, FiltaMax)

  • Elution و Immunomagnetic Separation (IMS) برای جداسازی کیست/اوسیست

  • IFA (Immunofluorescence Assay) با آنتی‌بادی FITC‑conjugated

  • RT‑qPCR برای تایید و کمی‌سازی

• دستگاه‌ها و لوازم

  • پمپ خلأ یا پمپ فشار برای فیلتراسیون حجم بالا

  • مانیتور IMS kit (Dynabeads)

  • میکروسکوپ فلورسنس

  • ترموسی سایکلر برای qPCR

• استانداردها و روش‌های مرجع

  • EPA Method 1623 (IMS + IFA)

  • ISO 15553 (MudPIT/IFA)

  • ISO 18744 (Detection by qPCR)

• نکات اجرایی

  • جلوگیری از باکتریواستیل توسط افزودن Tween‑80 در Elution

  • کنترل recovery با استفاده از کیست/اوسیست اسپایک

  • blank فیلتر و process control

۶. ویروس‌ها (Hepatitis A, Norovirus)

• روش‌های اجرایی

  • غلظت‌سازی با PEG‑NaCl یا فیلتراسیون الکتروپوزیتیو

  • Elution و Concentration مجدد با Centrifugal Concentrators

  • RNA Extraction با کیت‌های ستون سیلیکاتی

  • RT‑qPCR یک‌مرحله‌ای یا دو‌مرحله‌ای برای ژن‌های VP1 (HAV) و ORF1–ORF2 (Norovirus)

• دستگاه‌ها و لوازم

  • پمپ‌های غلظت‌سازی و فیلتراسیون الکتروپوزیتیو

  • سانتریفیوژهای با سرعت بالا (≥ 10 000 × g)

  • دستگاه استخراج RNA اتوماتیک

  • Real‑Time PCR thermocycler

• استانداردها و روش‌های مرجع

  • ISO 15216‑1/2 (Quantification of HAV and Norovirus in water)

  • EPA Method 1615 (Detection of Enteric Viruses by RT‑qPCR)

• نکات اجرایی

  • افزودن Process Control Virus (e.g. mengovirus) برای اصلاح recovery

  • استفاده از کنترل‌های منفی و مثبت در هر run

  • جلوگیری از آلودگی متقاطع با جداسازی محلول‌های pre‑ and post‑PCR

خلاصه:
مجموعه آزمون‌های میکروبیولوژیک آب و فاضلاب شامل کشت‌های کلاسیک (MPN, MF), روش‌های کروماتوگرافیک/ایمونوفلورسنت و روش‌های مولکولی (PCR/RT‑qPCR) است. رعایت نمونه‌برداری مناسب، حفظ sterile conditions، کنترل recovery و QC (blank, spike, duplicate) و پیروی از استانداردهای ISO/EPA/APHA برای حصول نتایج دقیق و معتبر حیاتی است.

مرجع تخصصی آب و فاضلاب